Metagenomics to Identify Pathogens in Diabetic Foot Ulcers and the Potential Impact for Clinical Care

מטה-גנומיקה לזיהוי פתוגנים בכיבי כף רגל סכרתית וההשפעה הפוטנציאלית על הטיפול הקליני

תקציר

זיהומים בכף רגל סוכרתית מערבים לעיתים מס' רב של חיידקים. עם זאת, עדיין האנליזה של זיהומים אלו מתבססת על שיטות התרבית הקונבנציונליות. טכנולוגיית המטה-גנומיקה (Metagenomics next generation sequencing - mNGS) מאפשרת הערכה שלמה ומהירה יותר של הרכב החיידקים בהשוואה לתרבית הקונבנציונלית, אך עדיין נדרש המשך מחקר טרם שילובה בשימוש קליני. מאמר זה סוקר את יכולות טכנולוגיה זו, מגבלות הכנסתה לשימוש קליני וכן פתרונות פוטנציאליים למגבלות אלו.

רקע

קיים מחקר קליני נרחב על הפתוגנים השונים המצויים בכיב מזוהם בכף רגל סוכרתית (DFU – Diabetic Foot Ulcer), אם כי כלל מורכבותו של המיקרוביום לא מוערך כראוי. התרביות הקונבנציונליות הנמצאות בשימוש כיום לאיתור המחוללים המזהמים ב-DFU אמנם רגישות לפתוגנים הנפוצים, אך אינן רגישות לכלל המיקרוביוטה וכמו כן נדרשים מספר ימים עד לזיהוי הפתוגנים ובדיקת הרגישויות.

עם התפתחות טכנולוגיות הריצוף הגנטי, נעשה גם ריצוף גנטי לחיידקים המצויים בתוך פצע. הדבר מתבסס על אמפליפיקציה (הכפלה מרובה) של הגן הריבוזומלי 16S הייחודי רק לחיידקים ולא לאדם – ובאמצעותו איתור מספר רב של חיידקים. כמו כן, ניתן להכפיל ולרצף רצפים קצרים ידועים של חיידקים – בכדי לאשרר את הימצאותם או העדרם בתרבית. עם זאת, שיטות ריצוף אלו הינן יקרות ולא ישימות לשימוש קליני, וכן מאפשרות זיהוי חלקי בלבד של החיידקים.

ריצוץ מטה-גנומי Metagenomic sequencing -

ריצוף מטה-גנומי או mNGS (Metagenomic next-generation sequencing), היא שיטה שאינה דורשת אמפליפיקציה ועל כן אינה מוגבלת לאיתור זנים ידועים בלבד וניתן להגיע לסיווג טקסונומי ברמת הזן הספציפי של החיידק. ריצוף nanopore, היא שיטה המזהה רצף נוקלאוטידים בהתבסס על ההפרעה הנמדדת בזרמי האלקטרונים הנגרמת על ידי זוגות בסיסים (base-pairs) העוברים דרך חור ננומטרי (מכאן שמה). שיטה זו מאפשרת קריאה של רצפי DNA ארוכים – ואינה מסתמכת על אמפליפיקציה לפי רצפים ידועים מראש. באמצעות שיטה חדשנית זו ניתן לרצף את כלל ה-DNA המיקרוביאלי בדגימה.

בניסיון פיילוט ראשוני, נלקחה דגימת עצם ממטופל עם DFU במהלך ניתוח והועברה לריצוף nanopore. לאחר ריצוף כלל ה-DNA בדגימה, בניתוח הביואינפורמטי של תוצאות הריצוף, הוחרגו כל הרצפים האנושיים מהקריאה, והרצפים הנותרים הוצלבו עם מאגרי מידע גנטיים ידועים של חיידקים. התוצאה מדגימה את העושר הטקסונומי המרשים שניתן להשיג בקליניקה מדגימת עצם.



יישומים קליניים אפשריים

Diabetic Foot Ulcers

התפתחותן של שיטות חדשות לזיהוי פתוגנים ב-DFU שאינן תלויות תרבית חשפו את עושר ומורכבות המיקרוביום של DFU. הפתוגנים הדומיננטים ב-DFU כללו את זני ה-Streptococcus וה-Staphylococcus, וכיום, בזכות שיטות הריצוף החדשות, התגלו מספר רב של חיידקים נוספים, ביניהם מגוון זני Staphylococcus spp., Corynebacterium spp,, Streptococcus spp. ו-Propionibacterium spp.. בנוסף, בשיטות החדשות ניתן לאתר גם זנים אנאירוביים – אשר קיים קושי לאתרם בשיטות התרבית הקונבנציונליות, וכן הדגים נוכחות זנים פטריתיים בפצע. ישנו מתאם גבוה בין הריצוף הגנטי לבין התרביות הקונבנציונליות – דבר המצביע על כך שהריצוף הגנטי יכול לשמש כלי תומך בקבלת החלטות טיפוליות, אם כי עדיין יש מקום לחקור את המשמעות הפתגונית של כלל האורגניזמים אשר מאותרים בשיטות אלו.

אורגניזמים עמידים לטיפול אנטיביוטי

נוכחות חיידקים עמידים במיוחד multi-drug resistance בפצע מגבירה את הסיכון לעיכוב בהחלמת פצע, השנות כיב, כישלון טיפולי ותמותה מוגברת. השיטות החדשות יכולות לאפשר זיהוי של גנים לעמידויות לאנטיביוטיקה המצויים בחיידקים ולסייע בקבלת ההחלטות הטיפוליות. כמו כן, מיקרוביום הטרוגני ועשיר בפצע הוכח כמפחית מיגרציה של תאים מזנכימליים ובכך פוגם בתהליך ריפוי הפצע, ועל כן יש חשיבות לזיהוי שלו במהלך הטיפול.

הגבלות וכיוונים עתידיים

מספר בעיות מעכבות את כניסת הטכנולוגיות החדשות לשימוש קליני:

ראשית, ישנו חוסר תיאום בספרות בנוגע לשיטת איסוף הדגימה, סוג הדגימה הנאספת, וזמן לקיחת הדגימה מהפצע. למשל, במאמרים שונים הדגימה נלקחת לפני ביצוע הטריה, במהלכה או לאחריה, דבר המשפיע על תוצאות הבדיקה. כמו כן, מחקרים רבים עושים שימוש במטוש פצע (Levine technique), למרות שדגימה כזאת מכילה רק את פני השטח של הפצע ולא כוללת את כלל האוכלוסייה החיידקית. חוסר התיאום הטכני בין המחקרים מקשה על השוואת תוצאות וסטנדרטיזציה, ויש צורך ביצירת מוסכמות בתחום.
שנית, הפן הכלכלי: עלות ממוצעת של תרבית אירובית, אנאירובית, acid-fast, ותרבית פטריייתית גם יחד הינה 100 דולר, בעוד ריצוף בשיטת mNGS עולה כמה מאות דולרים. פתרון עתידי לכך עשוי להיות ריבוב (multiplexing) – ביצוע מספר אנליזות יחד, במקום ביצוע של כל אנליזה בנפרד.

כמו כן, ישנן מספר בעיות אינהרנטיות בטכנולוגיות הריצוף החדשות: הן אינן מבדילות בין אורגניזמים מתים לחיים, ואף לא בין אורגניזמים סימביוטיים לאורגניזמים פעילים. הן גם בעלות שיעור טעויות גבוה יותר משיטות ריצוף אחרות – שיעור הנמצא בטווח 5-10%. מכאן שיש צורך באיסוף מידע ביואינפורמטי רב באמצעות NGS לפני שהשימוש במטה-גנומיקה יוכל להיכנס לשימוש קליני.

המגבלה המרכזית של שיטות אלו היא האבחנה בין עיקר וטפל. האם אכן כל הפתוגנים המאותרים בשיטות גנטיות אלו הינם משמעותיים קליניים ומחייבים טיפול תרופתי. המשך מחקר הבוחן את המתאם בין המיקרוביום, הקליניקה, הטיפול האנטיביוטי והתוצאים יסייע בניצול מושכל יותר של טכנולוגיה זו.

לצפייה במאמר המלא